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Pour un microscopiste électronicien qui a consacré presque toute sa carrière de recherche à l'étude des rétrovirus associés aux leucémies de souris et qui a suivi avec grande attention l'impact hypothétique que de telles recherches auraient pu avoir dans l'étude des cancers chez l'homme, il était prévisible que les recherches actuelles sur le Sida allaient s'engager dans une fausse direction. Comment était-ce prévisible ? Les souvenirs rassemblés ci-après ont pour but de le faire comprendre. L'importance de la microscopie électronique dans le développement de la biologie cellulaire moderne, entre 1945 et 1965, est unanimement reconnue. Les relations qui unissent structures et fonctions cellulaires n'auraient, sans aucun doute, jamais pu être bien comprises sans l'utilisation du très grand pouvoir séparateur du microscope électronique (ME). Cependant, ce qui n'est peut-être pas aussi généralement apprécié c'est le rôle que la virologie a exercé dans l'étude des ultrastructures cellulaires. Historiquement, lorsqu'en 1931 Rüdenberg (1) introduisit une demande de brevet pour son invention du microscope électronique, son espoir principal était d'arriver à visualiser le virus de la poliomyélite ! Et durant la seconde guerre mondiale, lorsque les microscopes électroniques commençaient à devenir accessible aux biologistes, priorité était données aux efforts faits pour découvrir des particules virales associées aux cellules cancéreuses de certains animaux de laboratoire. C'est ainsi que Albert Claude, travaillant à l'Institut Rockefeller de New York réussi à démontrer le virus du sarcome de Rous dans des fibroblastes de poulet (2). Et quelques années plus tard, Keith Porter et ses associés ont eu un succès similaire en obtenant des images du "facteur lacté" dans des cellules d'adénocarcinomes mammaires de la souris (3). L'origine virale du sarcome de Rous chez la poule et des tumeurs mammaires chez les souris semblait bien établie par des expériences microbiologiques basées sur les techniques d'ultrafiltration et réalisées bien avant que les premières images de microscopie électronique ne soient publiées. Et cependant, l'observation directe des particules virales dans ces tumeurs expérimentales donnèrent un élan extraordinaire (aujourd'hui, nous dirions peut-être excessif !) à la recherche des virus en cancérologie. L'origine virale de certains cancers chez les souris et les poules avait été clairement démontrée par des expériences d'ultrafiltration qui permettaient d'évaluer approximativement le diamètre des particules virales. Les microscopistes électroniciens connaissaient donc à l'avance la dimension des particules qu'ils devaient tenter d'identifier, cette dimension étant fréquemment d'à peu près 100 nm. Ceci facilitait l'identification initiale de virus dits "oncogènes" par la microscopie électronique bien qu'il apparu clairement, par la suite, que d'innombrables microvésicules ou éléments particulaires de cellules normales présentent approximativement le même diamètre. La découverte par Charlotte Friend, travaillant au Sloan Kettering Institute de New York, d'une érythroleucémie de souris transmissible par filtrats acellulaires illustre bien les méthodes de recherche utilisées vers les années 1955. Par surcroît, comme il se fait que j'ai commencé à travailler dans le laboratoire du Dr. Charlotte Friend à ce moment-là, les principes que nous appliquions à nos recherches me sont particulièrement familiers. Pour la microscopie électronique, nous donnions priorité à deux sortes d'échantillons: 1) différents tissus provenant de souris "Suisse" leucémiques (rate, ganglions lymphatiques, thymus et moelle osseuse), et 2) des culots obtenus par l'ultracentrifugation de filtrats acellulaires de tissus leucémiques, filtrats dont nous savions qu'ils transmettaient efficacement la maladie par injection à des souris "Suisse" adultes, ou à des souris de la souche DBA/2. Nous savions, par des expériences de filtration, que l'activité (c-à-d le pouvoir de transmettre la leucémie) disparaissait quand nous utilisions des filtres dont le diamètre des pores était inférieur à 200 nm. Les théories classiques de l'ultrafiltration nous permettaient donc de prédire que les particules infectieuses devaient avoir un diamètre proche de 100 nm. L'étude au microscope électronique, par la technique des coupes ultrafines, de tissus leucémiques révéla fréquemment des particules de ce diamètre, étroitement associées à diverses cellules. Les particules apparaissaient comme entourées d'une simple membrane et avaient en leur centre un noyau, ou nucléoïde dense aux électrons. Leur ultrastructure était caractéristique et leur diamètre remarquablement constant. A notre connaissance, de telles particules ne ressemblaient à aucun composants connus des cellules normales. Mais cependant, elles ressemblaient à des particules identifiées par d'autres auteurs dans plusieurs tumeurs "filtrables" expérimentales et classifiées par W. Bernhard de particules de "type C" (4). En plus, nous avons observé des particules identiques dans des culots préparés par l'ultracentrifugation de filtrats acellulaires capables de transmettre la maladie à des souris susceptibles. C'est sur la base de ces données-là que nous avons émis l'hypothèse selon laquelle ces particules représentaient en effet le virus "oncogène" étiologiquement lié à l'érythroleucémie de Friend (5). Nous étions toutefois surpris d'observer le virus en étroite association avec des cellules qui n'étaient apparemment pas impliquées dans le processus leucémique, telles que les mégacaryocytes de la moelle osseuse, par exemple. Ces études au microscope électronique avaient également montré, dès le début, que toutes les particules denses aux électrons et d'un diamètre voisin de 100 nm n'étaient pas des virus, et qu'une analyse ultrastructurale rigoureuse était essentielle pour distinguer d'une manière appropriée les virus et les "virus-like particles". Fort heureusement, nos études au microscopie électronique ont rapidement permis d'ajouter une donnée importante pour l'identification des virus oncogènes à ARN. Il est en effet apparu que ces virus se formaient au niveau de la surface cellulaire, la membrane cellulaire des cellules infectées contribuant directement à la formation de la future enveloppe virale par une série d'étapes auxquelles nous avons donné le nom de phénomène de bourgeonnement ("budding") (6). Les virus sont libérés dans les espaces intercellulaires par ce processus de bourgeonnement. L'identification au microscope électronique des virus de ce groupe est, de ce fait, devenue plus rigoureuse, l'observation de particules en voie de bourgeonnement étant désormais requise. Ceci a probablement permis d'éliminer des milliers d'images de "virus-like particles" observées dans des cancers chez l'homme et avec lesquelles des microscopistes électroniciens par trop enthousiastes tentèrent de contaminer ... la littérature médicale ! En plus, l'observation de particules en voie de bourgeonnement au niveau des surfaces cellulaires nous permettait d'identifier les cellules infectées, une à une, et de conclure que celles-çi sont parfaitement viables, en l'absence de tout signe de lyse des cellules infectées, l'infection par des virus de ce type n'ayant donc aucun effet cytolytique. Par surcroît, les virus s'identifiaient clairement dans des cellules en voie de division mitotique (7). Puisque, de toute évidence l'expérimentation chez l'être humain est inacceptable, l'éventuelle observation dans des cellules cancéreuses humaines de particules ressemblant à celles décrites dans les tumeurs expérimentales aurait pu être d'un grand intérêt, encore qu'insuffisante pour tirer la moindre conclusion. Dans les années 1960, de nombreux laboratoires du monde entier, utilisant les derniers raffinements des techniques de microscopie électronique, tentèrent de faire cette démonstration. A cette époque, c'est-à-dire bien avant l'émergence de la biologie moléculaire, la microscopie électronique était, sans aucun doute, la méthode de choix pour tenter d'identifier des virus dans des échantillons cellulaires. Le rôle crucial de la microscopie électronique en virologie fut d'ailleurs particulièrement souligné lors d'une conférence à Cold Spring Harbor, en 1962, lorsque Lwoff, Horne et Tournier proposèrent de baser toute la classification des virus sur les caractères morphologiques démontrés par la microscopie électronique (8). Continuant nos recherches sur le virus de la leucémie de Friend, et encouragés par le Dr. J. Beard de la Duke University(Durham, Caroline du Nord) qui avait une expérience considérable des leucoses aviaires, nous orientèrent nos efforts vers la démonstration, par microscopie électronique, d'une virémie (présence de virus dans le sang circulant) chez les souris leucémiques. L'étape initiale la plus efficace pour purifier le virus des leucoses aviaires était de commencer non pas en utilisant non pas les tissus mais bien le plasma sanguin des poulets leucémiques. Cette donnée était pour nous de la plus grande importance car, en effet, nous n'obtenions pas de résultats très satisfaisants, en termes de purification du virus de Friend, lorsque nous utilisions des homogénats de tissus leucémiques tels que la rate ou les ganglions lymphatiques. Nous avons donc mis au point une méthode de purification fort simple à partir du plasma sanguin des souris, et basée sur une double ultrafiltration sur membranes "Millipore". Un échantillon dilué de plasma, 10 ml provenant de la saignée d'environ 25 souris leucémiques, était d'abord clarifié par aspiration au travers d'un filtre de porosité 0.65 um; le premier filtrât était alors soumis à une seconde filtration, cette fois en utilisant un filtre de 0.22 um. Le second filtrât était alors centrifugé pendant 120 minutes, à 30.000g. Il en résultait un culot de centrifugation extrêmement petit, à peine visible, mais qu'il y avait moyen de préparer pour la microscopie électronique. Les coupes ultrafines de ces culots révélaient au microscope électronique la présence d'une remarquable population de virus typiques et bien préservés, tassés les uns contre les autres, et avec très peu de contamination par des débris cellulaires (9). Telle était notre approche de la démonstration de la virémie en 1965... Et pendant ce temps-là, de nombreux laboratoires de microscopie électronique centrés sur la cancérologie (celui du Dr. W. Bernhard, à Villejuif, en France, du Dr. A.J Dalton, au National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, du Dr. L. Dmochowski, au MD Andrerson, Houston, Texas, et le nôtre, au Sloan Kettering Institute de New York), investissaient une part énorme de leur temps de recherche en s'efforçant de démontrer des particules virales associées au cancer chez l'homme. Des "virus-like particles" ont été occasionnellement observées, mais n'ont convaincu personne ! Des particules virales typiques n'ont jamais pu être démontrées d'une manière concluante. Et ceci contrastait d'une façon flagrante avec la facilité avec laquelle on pouvait démontrer, par microscopie électronique, les virus dans plusieurs leucémies et cancers chez les souris et les poules. Très peu de publications ont été consacrées à ces résultats négatifs sur les cancers et les leucémies chez l'homme. Et cependant, Haguenau, en 1959 (10), soulignait la difficulté qu'il y avait à identifier la moindre particule virale dans une grande série de cancer du sein. Bernhard et Leplus, en 1964 (11), dans un livre consacré à l'étude d'un grand nombre de cas de maladie de Hodgkin, de lymphosarcomes, de leucémies lymphoides et de maladies métastatiques, ne sont pas parvenus à identifier de particules virales associées à ces diverses conditions pathologiques. Au Sloan Kettering Institute, à New York, j'ai décidé, en 1965, d'arrêter toute étude au microscope électronique des cas de leucémies et de lymphomes pour la présence de particules virales, après plusieurs années de recherche entièrement négatives. J'ai fait rapport sur cette décision lors d'une conférence sur "Methodological Approaches to the Study of Leukemias" qui s'est tenue à Philadelphie, au Wistar Institute, en 1965 (12). Des souris et des hommes.... La publication de tous ces résultats négatifs n'est pas parvenues à décourager les fanatiques chasseurs de virus ! Une explication de ces résultats négatifs devait donc être trouvée ailleurs ! La technique des coupes ultra-fines en microscopie électronique n'était peut-être pas la meilleure ? (bien qu'elle réussissait si bien chez les souris !). La préparation des coupes ultrafines prenait beaucoup de temps et exigeait beaucoup d'adresse ! Qui avait encore le temps pour cela quand les crédits de recherche devenaient difficiles à obtenir et quand les géants de l'industrie pharmaceutique commençaient à offrir des contrats alléchants pour des réponses rapides ? Pourquoi ne pas essayer la technique des colorations négatives ? C'est très facile, et cela va très vite ! Et, après tout, cette technique avait donné des résultats remarquables dans l'étude de virus dépourvus d'enveloppe tels que les adénovirus et le polyome. Les résultats furent absolument désastreux en ce qui concerne les virus à ARN associés aux tumeurs (pas encore appelés rétrovirus...), car ces virus sont fragiles et sont tout-à-fait déformés par le séchage à l'air qui fait immanquablement partie de la technique de coloration négative; vus par cette technique, les virus apparaissent comme des particules munies d'une longue queue ! Malheureusement, de nombreux débris cellulaires et de nombreuses microvésicules, après séchage à l'air pour coloration négative, forment eux aussi des profiles de particules munis d'une queue. La tentation d'interpréter toutes les "particules avec queue" comme des virus oncogènes à ARN était était grande et apparaissait comme une aubaine extraordinaire pour les chasseurs de virus ! Et pourtant, nous avions clairement démontré que les "virus avec une queue" étaient des artéfacts dus à la technique de coloration négative, artéfacts qui pouvaient être facilement évités par un contrôle approprié du pouvoir osmotique et par la fixation à l'acide osmique précédant la coloration négative (13), ou encore par la technique du séchage au point critique (14). L'énorme confusion créée par les publications sur les "tailed particles" a fait un tort considérable à la crédibilité accordée à la microscopie électronique en matière de recherche de virus associés aux cancers. On recherchait des "tailed particles" dans le lait de vache et le lait humain, et Sol Spiegelman parlait avec éloquence des risques de l'allaitement maternel... Une découverte importante, qui n'avait strictement rien à voir avec la microscopie électronique a complètement réorienté les idées concernant le mode d'action possible des virus oncogènes à ARN. C'est la découverte par Temin et Baltimore, en 1970, de l'enzyme "transcriptase inverse" (reverse transcriptase, RT). On commençait apparemment à deviner comment il était possible pour des virus oncogènes à ARN de modifier le génome des cellules infectées. Par surcroît, ces virus demeuraient de bons candidats comme possible facteurs "oncogènes" car ils étaient bien reconnus comme NON cytolytiques (c-à-d qu'ils ne tuent pas les cellules qu'ils infectent). En conséquence, les virus oncogènes à ARN furent rebaptisés. On décida de les appeler "Rétrovirus" (rétro, pour RT). Les crédits fédéraux accordés à l'étude de leur rôle éventuel dans la cause du cancer chez l'homme, immédiatement après le passage au Congrès des E-U du "War Against Cancer Act" de R. Nixon, ont atteints des niveaux tout-à-fait surprenants, bien supérieurs à ce que l'on pouvait attendre pour l'étude d'une hypothèse qui, quoiqu'intéressante, restait totalement indémontrée...
L'orientation des efforts de recherche changea considérablement après la découverte de la transcriptase inverse (RT), c'est-à-dire après 1970. En fait, toutes les méthodes qui avaient dominé l'étude de l'oncologie virale depuis 1950 jusqu'en 1970 furent progressivement remplacées par une mode très exclusive des méthodes de la biologie moléculaire. J'ai observé cette évolution plutôt de l'extérieur, car, à mon avis la microscopie électronique n'était plus la méthode principale qui permettrait d'avancer dans l'étude des relations hypothétiques qui existeraient entre les rétrovirus et les cancers chez l'homme. Les années 1970-1980 furent dominées par une série d'idées dont la valeur scientifique n'aurait jamais été acceptée 10 ou 20 ans auparavant. Par exemple: 1. Il devenait acceptable d'affirmer que, lorsque des virus ne pouvaient pas être identifiés par la microscopie électronique, d'autres méthodes de nature biochimique ou immunologique, supposées capable d'identifier des "marqueurs" viraux, étaient suffisantes pour démontrer l'infection virale des cellules étudiées. Ces "marqueurs" pouvaient être un enzyme (RT), un antigène, diverses protéines, ou certaines séquences d'ARN. Le fait de n'avoir jamais vu au microscope de particules virales était expliqué d'une façon fort commode par l'intégration du génome viral dans les chromosomes des cellules prétendument infectées. Accepter une telle interprétation impliquait l'ignorance complète de tout ce que nous avions appris durant l'étude des cancers expérimentaux des animaux de laboratoire Il faut toutefois reconnaître que, dans ces modèles expérimentaux, la microscopie électronique ne permettait d'observer que l'étape finale de la multiplication virale, les étapes initiales consistant en une série d'événements moléculaires qui échappent complètement aux images ultrastructurales. Et pourtant, dans tous les systèmes expérimentaux classiques tels que les leucoses aviaires ou murines, les phases terminales de la réplication virale (le bourgeonnement, "budding") étaient toujours observées et considérées comme essentielles à la propagation de l'infection virale d'une cellule à l'autre. 2. Un autre court-circuit aux conséquences désastreuses fut cette notion fort naïve selon laquelle tout matériaux biologiques sédimentant sur gradient de sucrose à la densité 1.16gr/ml étaient de nature rétrovirale ! Sans aucun doute, les rétrovirus bien caractérisés sédimentent au voisinage de cette densité. Mais ceci n'implique pas que tout ce qui sédimente à cette densité soit de nature rétrovirale ! Dans les années 1960, des collègues biochimistes me demandaient souvent de regarder (au microscope électronique) certaines "bandes" sédimentant à la densité 1.16: "Regarde bien ceci, ça forme une bande nette à 1.16, ce doit être du pur rétrovirus !". Les culots d'ultracentrifugation obtenus à partir de ces fameuses "bandes 1.16" , étudiés en coupe fines par microscopie électronique, permettaient de reconnaître une grande variété de microvésicules et de débris cellulaires, mais pas un seul rétrovirus ! Et cependant cette méthode de sédimentation à la densité 1.16 est toujours utilisée pour identifier de prétendus "marqueurs" viraux ! Comme il est désolant de penser qu'un contrôle adéquat au microscope électronique de ces fameuses "1.16 bands" (ce qui prend environ 2 jours et coûte quelque centaines de dollars seulement) aurait pu éviter ces interprétations dangereuses de prétendus "marqueurs rétroviraux" sur lesquels d'énormes budgets de recherche ont été lamentablement gaspillés... 3. L'isolement de virus à partir du surnageant de cultures cellulaires infectées soulève d'autres questions. Nous nous souvenons tous de la découverte, par Epstein (15) en 1964 du virus EB dans des cultures cellulaires obtenues à partir de cas africains de lymphome de Burkitt. Cette découverte était basée sur la microscopie électronique et ce virus fut immédiatement et correctement classifié comme un membre du groupe herpès. Pour identifier ce virus dans les cellules en culture il était préférable d'observer des cellules en voie de dégénérescence, car, de toute évidence, ce virus avait en effet cytolytique marqué. Tout au contraire, les cellules infectées par les rétrovirus conservent une excellente viabilité, ce qui permet d'isoler ces virus à partir du surnageant des cultures, avec un minimum de contamination par des débris cellulaires et sans aucune nécessité de traiter les cellules par des lymphokines ou d'autre facteurs de croissance. 4. En ce qui concerne la politique de recherche scientifique, il était manifeste que la recherche sur de prétendus virus oncogènes était dominée par l'hypothèse rétrovirale. Les crédits d'origine fédérale prenaient presque tous cette même direction, d'autant plus que l'idée très naïve prévalait selon laquelle le succès de la recherche scientifique était avant tout ...une question de gros sous ! L'ampleur des crédits accordés a permis la création d'un appareil de recherche rétrovirale considérable, avec de nombreux nouveaux emplois. Malheureusement, la liberté intellectuelle de penser d'en d'autres directions de la recherche cancérologique allait s'amenuisant, d'autant plus que les géants de l'industrie pharmaceutique commençaient à offrir des contrats presqu'irrésistibles, polarisés fort exclusivement sur la recherche rétrovirale... La plus haute priorité était de démontrer, à n'importe quel prix, que les rétrovirus avaient quelque chose à voir avec l'origine du cancer chez l'homme, hypothèse qui n'avait cependant pas reçu le moindre support expérimental pendant toutes les années 1960 et 1970. Un effort de recherche aussi mal dirigé n'aurait peut-être eu que peu de conséquence aussi longtemps que la santé publique n'était pas directement en cause. Fort malheureusement, l'appartion du Sida, le syndrome d'immunodéficience acquise, en 1981, a rapidement transformé ce qui aurait pu n' être qu'un un regrettable faux-pas académique en une véritable tragédie. Ce qui est advenu après 1981 est tellement bien connu des lecteurs de "Reappraising Aids" que j'hésite d'élaborer dans le détail. Les événements qui ont conduit à la crise actuelle ont été récapitulés et analysés de la façon la plus convaincante par Peter Duesberg (16). Je dois reconnaître avoir lu le livre de Duesberg (1996) avec la plus grande attention quoiqu'essentiellement sans surprise, tellement la recherche rétrovirale avait, dans les années 1970, dangereusement préparé la scène pour "Impure Science" (17). Peu après que les premiers cas de ce qu'on a commencé par appeler le "Gay related immune deficiency" (GRID) furent décrit par Michael Gotlieb il était clair pour tous les observateurs que Gallo et ses associés allaient se consacrer à corps perdu au nouveau syndrome qui leur apparaissait comme une occasion inespérée pour tenter de justifier les budgets fédéraux considérables qu'ils avaient consacrés à l'étude des rétrovirus pendant les 10 dernières années. Car il faut se rappeler que, en 1980, la communauté scientifique s'impatientait de plus en plus devant le manque complet de résultats de la "Guerre contre le Cancer" basée sur la chasse aux virus. L'épisode mineur de HTLV-1 ne suffisait pas, loin s'en fallait, pour apaiser les craintes d'avoir grossièrement gaspillé les fonds de recherche fédéraux. Et le fait que le nouveau syndrome , rapidement renommé "Sida", n'avait que fort peu de chose à voir avec le cancer n'embarassait pas Gallo plus que cela. La fréquente association du syndrome avec le sarcome de Kaposi permettait d'ailleurs de masquer la différence aux yeux du grand public. Dominé par les médias, par des groupes de pression et par les intérêts de plusieurs compagnies pharmaceutiques, la recherche officielle sur le Sida cherchait à contrôler la maladie, ayant perdu tout contact avec la libre pensée scientifique et avec la recherche médicale traditionnelle ("peer reviewed"). L'hypothèse VIH=SIDA qui n'avait toujours pas été démontrée, drainait 100% des crédits de recherche, alors que toutes les autres hypothèses étaient ignorées. On est parvenu à faire croire, tant au grand public qu'à la communauté médicale, que la présence d'anticorps dans le sang circulant permettait de faire le diagnostic d'une maladie évolutive, que les postulats de Koch étaient passés de mode, que 90% des cas d'une maladie infectieuse peuvent s'observer chez des patients du sexe masculin, que la virémie peut se mesurer par la technique du PCR en amplifiant des fragments d'ARN même quand les particules virales ne sont pas démontrables au microscope électronique, etc, etc.... Et pour conforter encore plus l'hypothèse officielle, on a trouvé préférable d'oublier qu'il était connu depuis des dizaines d'années que les héroïnomanes s'exposaient à de graves immunodéficiences, que l'inhalation de nitrite a de nombreux effets toxiques, que l'extrême toxicité de l'AZT était connue depuis 20 ans, que de tous les rétrovirus connus aucun n'a d'effet cytolytique, etc, etc.... De plus, pour permettre au "business Sida" de se développer avec profit, la recherche sur toute hypothèse dissidente (c'est-à-dire non-vih) fut soigneusement sapée par un contrôle très serré des fonds de recherche ainsi que par l'extrême difficulté qui est rapidement apparue de publier, n'importe où, la moindre opinion dissidente... Vers les années 1985, je considérais d'ajouter à mes programmes de recherche l'étude au microscope électronique de patients atteints du Sida. Malheureusement, les médias avaient déjà à ce moment-là orchestré la panique d'une épidémie pire que la peste, et mes assistants m'ont rapidement fait comprendre que si j'insistais dans cette direction ils quitteraient tous le labo ! Le test de la "séropositivité" était encore considéré à ce moment-là comme diagnostiquement fiable. Depuis lors, nous avons compris, par les travaux de Papadopulos et du groupe de Perth en Australie, que ce test est très loin d'être spécifique (18) ! Depuis que j'ai pris ma retraite en France, je saisis toutes les occasions qui se présentent à moi de parler aussi librement que possible des questions soulevées dans cet article. Je suis fier d'être un membre du "Groupe pour la ré-évaluation de l'hypothèse VIH-SIDA" basé en Californie. J'espère très sincèrement que les diverses activités de ce groupe vont provoquer la mise en route de nouvelles recherches sur les causes du Sida, pour le plus grands intérêt des malades, et pour la renaissance de l'intégrité scientifique en recherche médicale ! Adresse pour correspondance: Prof. Etienne de Harven, MD RÉFÉRENCES: © E deH
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